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饲料中霉菌毒素快速筛选检测技术

来源：重庆市农业农村委员会分类：科普知识时间：2020-08-20 15:12

一、技术概述

霉菌毒素是产毒霉菌在粮食和饲料上生长繁殖过程中产生的次级代谢产物，包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等，对养殖业及人体危害突出，特别是动物采食霉菌毒素污染的饲料后肉制品及奶制品残留霉菌毒素及霉菌毒素代谢产物，严重威胁人类健康。经采样调查，我国全价饲料霉菌毒素检出率高达90%以上。鉴于此，我中心向我市饲料生产企业推广霉菌毒素快速筛选检测技术，旨在将饲料生产投入原料及进入市场的饲料产品的霉菌毒素含量控制在国家标准限定范围，确保畜产品质量安全及养殖业健康发展。

饲料中霉菌毒素快速筛选检测方法为酶联免疫吸附法，利用抗原抗体的特异反应，将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应来定量测定。操作简单、快速灵敏、结果可靠，对设备要求不高，适合饲料生产企业开展饲料原料及饲料中霉菌毒素筛选检测工作。

二、技术要点

（一）明确霉菌毒素快速筛选检测范围。霉菌毒素主要分布在谷物等农作物，据联合国粮农组织调查分析，全球范围内每年有四分之一的农作物在不同程度上受到霉菌毒素的污染，谷物原料在田间被霉菌污染后，运输、加工、储存过程中环境温度、湿度控制不当，霉菌会继续生长繁殖，霉菌毒素含量也会相继增加。因此饲料生产企业可在两个环节对饲料中霉菌毒素进行筛选检测，一是对饲用谷物原料进行霉菌毒素快速筛选检测，以确保饲料生产投入谷物原料霉菌毒素含量在国家标准规定的范围内，二是对生产的配合饲料进行霉菌毒素筛选检测，以确保配合饲料在生产、存放以及进入市场时，霉菌毒素含量在国家标准规定的范围内。

检测方案

1.原理：检测依据是抗原-抗体反应，将霉菌毒素抗体的羊抗体吸附在固相载体表面，加入霉菌毒素抗体、酶标霉菌毒素结合物、霉菌毒素标准或检测液，在霉菌毒素抗体与固相载体表面羊抗体结合的同时，游离的霉菌毒素、酶标霉菌毒素结合物与结合在固体表面的霉菌毒素抗体竞争结合，未结合的酶标霉菌毒素结合物洗涤除去。加入酶底物，在结合酶的催化作用下，无色底物降解产生蓝色物质。加入终止液后颜色转变为黄色。通过酶标检测仪，在450nm波长处测吸收值。吸光强度与检测液中霉菌毒素浓度成反比。

2.试剂与材料:包被抗体的聚苯乙烯微量反应板24孔或48孔；甲醇溶液；浓度分别为 0μg/L,5μg/L,15μg/L,45μg/L,135μg/L霉菌毒素标准品溶液；酶标抗原溶液（霉菌毒素与辣根过氧化酶结合物）；抗体溶液（抗霉菌毒素抗体）；柠檬酸缓冲溶液[0.1mol/L, pH =4.0]；底物溶液甲（四甲基联苯胺，用柠檬酸缓冲溶液(4.2.6)配成浓度为 0. 4 g/L）；底物溶液乙（取1.5mL 30%过氧化氢，用柠檬酸缓冲溶液稀释至 1 L）；底物溶液（底物溶液甲与底物溶液乙 1:1的混合液）；终止液[硫酸溶液(1+17)]。

3.仪器与设备：酶标检测仪（带450nm波长）；小型粉碎机；50μL,100μL,1000μL微量移液器；电动振荡器；玻璃器皿（50 mL锥形瓶、漏斗、量筒）；快速滤纸。

4.试样制备：200g饲料，经粉碎，混匀，装入磨口瓶中备用。

5.分析步骤：称取约5g试样(精确至0.01 g),置于50 mL具塞锥形瓶中，加人25 mL甲醇溶液, 密塞。振荡器提取10 min，提取液通过快速滤纸过滤。取1.0 mL滤液，加 19.0 mL蒸馏水稀释，摇匀，为试样液。取足够数量的微孔置微孔架上，标准品和试样做两个平等实验，记录标准品孔和试样孔的位置。在每孔中依次加人试剂:加入 50 μL标准溶液或试样液至相应微孔中；加入 50μL酶标结合物到每个微孔中；再加入50μL霉菌毒素抗体到每个微孔中；将酶标板轻轻摇晃，使孔中的试剂摇匀，置18℃-30℃恒温箱中反应10 min。将微孔中液体倾倒到水池内，倒置微孔支架，在干净纸巾上轻拍，除去所有残留的液体，用移液器加蒸馏水 250μL到每个微孔中，洗板，放置 2 min，再排空液体，重复洗涤 3次。加100μL底物溶液到每孔中，充分摇匀，置18℃-30℃恒温箱中，反应5 min。加 100μL终止液(4.2. 10)到每孔中，摇匀。在450 nm处，以空气为空白调零，测定吸收值。在 60 min内读数。

6.结果计算和表述：百分吸收值:所得的标准或试样的吸收值除以第一个标准(0标准)的吸收值再乘以 100，作为百分吸收值 A%，按下式算：A%=A÷A0×100，式中:A— 标准品或试样的吸收值; A0— 空白的吸收值。

标准曲线的绘制:所计算的百分吸收值对应霉菌毒素浓度(μg/L)的半对数坐标作标准曲线图，曲线在 5μg/L-135μg/L范围内应当成线性。根据试样的百分吸收值，通过标准曲线，查得相对应浓度。试样中霉菌毒素的含量(X)以微克每千克(μg/kg)表示，按下式计算：X=c×V×n÷m，式中:c—从标准曲线上查得相对应试样提取液中霉菌毒素浓度，单位为微克每升(μg/L);V试样提取液体积，单位为毫升(mL);n—试样稀释倍数;m—试样质量，单位为克(9)，计算结果表示到小数点后一位有效数字。

三、增产增效情况

通过向我市饲料生产企业推广霉菌毒素快速筛选检测技术，使饲料生产企业能够从原料投入到产品进入市场全程监测霉菌毒素污染情况，及时处理不合格饲料生产原料、不合格配合饲料产品，适时改善饲料生产及存放条件，从而显著提高饲料原料及配合饲料霉菌毒素监测合格率，减小不合格饲料产品进入市场比例，确保畜产品质量安全和养殖业健康发展。

四、支撑单位及专家

重庆市动物疫病预防控制中心侯亚莉、胡健

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标签

畜禽养殖